Gentamisin, duyarlı gram (-) bakterilerin neden olduğu solunum yolu enfeksiyonları, septisemi gibi ciddi enfeksiyonlar (neonatal sepsis dahil), kemik ve eklem enfeksiyonları, deri ve yumuşak doku enfeksiyonları (yanıklardan dolayı oluşan enfeksiyonlar dahil), postoperatif ve intraabdominal enfeksiyonlar gibi ciddi durumların kısa dönemli tedavisinde i.m. veya i.v. yoldan uygulanır. İlaç duyarlı gram (-) bakterilerin neden olduğu ciddi, komplike ve nükseden üriner enfeksiyonlarda da etkilidir; ancak daha az toksik antibiyotiklerin etkili olduğu, komplike olmayan üriner enfeksiyonların başlangıç tedavisinde kullanılmaz. Özellikle immunosupresif hastalarda ciddi Pseudomonas enfeksiyonlarının tedavisinde antipseudomonal etkili, geniş spektrumlu bir penisilinle (karbenisilin, mezlosilin, piperasilin, tikarsilin, tazobaktam) kombine olarak kullanılabilir. Gentamisin ve ß-laktam grubu antibiyotikler karıştırıldıklarında inaktive olduklarından ilaçlar ayrı ayrı uygulanmalıdırlar. Gentamisinin penisilin G veya ampisilinle birlikte kullanılması enterokokkal endokarditin tedavisinde endikedir. Karışık aerobik-anaerobik enfeksiyonların tedavisinde klindamisin ile kombine olarak uygulanır. Serebrospinal sıvıya diffüzyonu iyi olmadığından menenjit tedavisinde çok etkili değildir.
